Un microscopio elettronico (EM) è un tipo di microscopio che utilizza un fascio di elettroni per illuminare un campione e creare un'immagine notevolmente ingrandita. È stato inventato nel 1931 da ingegneri tedeschi. I microscopi elettronici hanno un potere risolutivo maggiore rispetto ai microscopi ottici che utilizzano radiazioni elettromagnetiche visibili . Possono raggiungere ingrandimenti molto più elevati fino a 2 milioni di volte, mentre i migliori microscopi ottici sono limitati a 2000 volte l'ingrandimento. Questi due tipi di microscopi hanno una risoluzione limitata, dettata dalla lunghezza d' onda della radiazione che utilizzano. La maggiore risoluzione e ingrandimento del microscopio elettronico è dovuta al fatto che la lunghezza d'onda di De Broglie di un elettrone è molto più piccola della lunghezza d' onda di un fotone di luce visibile.
Il microscopio elettronico utilizza lenti elettrostatiche ed elettromagnetiche per formare l'immagine controllando il fascio di elettroni e per farlo convergere su un piano particolare rispetto al campione. Il principio è simile a quello del microscopio ottico che utilizza lenti di vetro per focalizzare la luce sul o attraverso il campione per formare un'immagine.
Seguendo le elaborazioni teoriche di Louis de Broglie nel 1923, fu possibile dimostrare nel 1926 che i campi magnetici o elettrostatici potevano essere usati come lenti per fasci di elettroni.
Il primo prototipo di microscopio elettronico fu costruito nel 1931 dagli ingegneri tedeschi Ernst Ruska e Max Knoll . Questo primo strumento ingrandiva gli oggetti al massimo quattrocento volte. Due anni dopo, Russjai costruì un microscopio elettronico che superava la risoluzione possibile di un microscopio ottico. Reinhold Rudenberg , il direttore scientifico della Siemens , brevettò il microscopio elettronico nel 1931 , stimolato da una malattia in famiglia, per rendere visibile il virus della poliomielite. Nel 1937 Siemens iniziò a finanziare Ruska e Bodo von Borries per sviluppare un microscopio elettronico. Siemens ha anche impiegato il fratello di Helmut Ruska per lavorare sulle applicazioni, in particolare con campioni biologici.
Nello stesso decennio, Manfred von Ardenne iniziò la sua ricerca sul microscopio elettronico a scansione e sul suo microscopio elettronico universale. Siemens ha prodotto il primo microscopio elettronico disponibile in commercio nel 1938. Il primo microscopio elettronico statunitense è stato costruito presso l' Università di Toronto nel 1938 da Eli Franklin Burton (in) e gli studenti Cecil Hall , James Hillier e Albert Prebus . Il primo microscopio elettronico a trasmissione fu costruito dalla Siemens nel 1939. La realizzazione di un microscopio elettronico ad alta risoluzione non fu possibile fino a dopo l'invenzione dello stimmatore da parte di Hillier, nel 1946 nei laboratori della RCA. Sebbene i moderni microscopi elettronici possano ingrandire gli oggetti fino a due milioni di volte, sono ancora basati sul prototipo Ruska. Il microscopio elettronico è una parte essenziale dell'attrezzatura di molti laboratori. I ricercatori li usano per esaminare materiali biologici (come microrganismi e cellule ), un'ampia varietà di molecole , campioni di biopsie mediche, metalli e strutture cristalline e caratteristiche di diverse superfici. Il microscopio elettronico è anche ampiamente utilizzato per l'ispezione, la garanzia della qualità e l'analisi dei guasti delle applicazioni nel settore, inclusa, ma non limitata alla produzione di dispositivi semiconduttori .
La forma originale del microscopio elettronico, il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) utilizza il tungsteno come catodo della sorgente di elettroni . Il fascio di elettroni viene accelerato da un anodo generalmente a 100 keV (da 40 a 400 keV) rispetto al catodo , concentrato da lenti elettrostatiche ed elettromagnetiche, e trasmesso al bersaglio che è in parte trasparente agli elettroni e in parte li disperde. Quando emerge dal campione, il fascio di elettroni trasporta informazioni sulla struttura del campione che viene amplificata dal sistema di lenti dell'obiettivo del microscopio. La variazione spaziale di questa informazione (l '"immagine") viene vista proiettando l'immagine elettronica ingrandita su uno scintillatore , come il solfuro di zinco o il fosforo . L'immagine può essere registrata fotograficamente esponendo una pellicola o una lastra fotografica direttamente sul fascio di elettroni oppure una lastra al fosforo ad alta risoluzione può essere accoppiata tramite un sistema ottico o una fibra ottica al sensore di una camera CCD ( Charge-Coupled Device ) . L'immagine rilevata dal CCD può essere visualizzata su un monitor o diretta a un computer.
La risoluzione è limitata principalmente dall'aberrazione sferica , ma una nuova generazione di correttori sferici aumenta la risoluzione. Il software di correzione dell'aberrazione sferica per TEM ad alta risoluzione (HRTEM) ha consentito la produzione di immagini con una risoluzione sufficiente per mostrare gli atomi di carbonio nei diamanti, separati da soli 0,89 ångström (89 picometri ) e atomi di silicio a 0,78 ångström (78 picometri) a 50 ingrandimento milioni di volte. La capacità di determinare la posizione degli atomi nei materiali ha reso HRTEM uno strumento importante per la ricerca e lo sviluppo nelle nanotecnologie .
A differenza del TEM, dove il fascio di elettroni ad alta tensione trasporta l'immagine del campione, il fascio di elettroni dal microscopio elettronico a scansione (SEM) non può fornire un'immagine in qualsiasi momento. Campione completo. Il SEM produce immagini sondando il campione con un fascio di elettroni che, focalizzato, viene analizzato su un'area rettangolare del campione ( scansione raster (in) ). In ogni punto del campione, il fascio di elettroni incidente perde energia. Questa perdita di energia viene convertita in altre forme, come il calore, l'emissione di elettroni secondari bassa energia, l'emissione di luce ( catodoluminescenza ) o l'emissione di raggi X . Il display SEM rappresenta l'intensità variabile di uno di questi segnali nell'immagine, in una posizione corrispondente alla posizione del raggio sul campione quando il segnale è stato generato. Nell'immagine della formica a destra, l'immagine è stata costruita dai segnali prodotti da un rilevatore di elettroni secondario, la normale modalità di imaging convenzionale della maggior parte dei SEM.
Tipicamente, la risoluzione dell'immagine di un SEM è di circa un ordine di grandezza inferiore a quella di un TEM. Tuttavia, poiché l'immagine SEM si basa sui processi di superficie piuttosto che sulla trasmissione, è in grado di fornire immagini di oggetti fino a diversi centimetri con una grande profondità di campo, a seconda del design e dell'impostazione della fotocamera. immagini che sono una buona rappresentazione tridimensionale della struttura del campione.
Nel microscopio elettronico a riflessione , come nel microscopio elettronico a trasmissione, un fascio di elettroni è incidente su una superficie ma, invece di utilizzare la trasmissione (TEM) o gli elettroni secondari (SEM), sono gli elettroni riflessi del fascio, dispersi per elasticità, che è rilevato. Questa tecnica è comunemente associata alla Diffrazione di Elettroni ad Alta Energia di Riflessione (RHEED) e alla Riflessione dello Spettro di Perdita di Energia (RHELS). Un'altra variazione è la microscopia elettronica a bassa energia con polarizzazione spin (SPLEEM), che viene utilizzata per esaminare la microstruttura dei domini magnetici.
Il microscopio elettronico a trasmissione a scansione (MEBT, o STEM per microscopia elettronica a trasmissione a scansione ) è un tipo di modello il cui principio di funzionamento combina alcuni aspetti del microscopio elettronico a scansione e del microscopio elettronico a trasmissione. Una sorgente di elettroni focalizza un fascio di elettroni che passa attraverso il campione. Un sistema di lenti magnetiche consente a questo raggio di spazzare la superficie del campione da analizzare.
I materiali destinati ad essere visualizzati al microscopio elettronico possono richiedere un trattamento per produrre un campione adatto. La tecnica richiesta varia a seconda del modello e dell'analisi richiesta:
I microscopi elettronici sono costosi da costruire e mantenere, ma i costi di produzione e funzionamento dei sistemi di microscopia confocale ora superano quelli dei microscopi elettronici di base. I microscopi elettronici sono dinamici piuttosto che statici nel loro funzionamento, richiedendo l'erogazione di alta tensione molto stabile, correnti estremamente stabili a ciascuna bobina / lente elettromagnetica, vuoto o ultra-vuoto pompato continuamente e raffreddamento mediante circolazione di acqua, lenti e pompe. Essendo molto sensibili alle vibrazioni e ai campi magnetici esterni, i microscopi, per consentire risoluzioni più elevate, devono essere alloggiati in edifici stabili (a volte interrati), con sistemi speciali come i sistemi di cancellazione del campo magnetico. Alcuni microscopi elettronici da tavolo a bassa tensione hanno capacità MET a bassissima tensione (circa 5kV), senza una tensione di alimentazione rigorosa, acqua di raffreddamento o isolamento dalle vibrazioni. Sono molto più economici da acquistare e molto più facili da installare e mantenere, ma non hanno la stessa altissima risoluzione (scala atomica) degli strumenti più grandi.
I campioni dovrebbero essere generalmente esaminati sotto vuoto perché le molecole che compongono l'aria disperdono gli elettroni. Un'eccezione è il microscopio elettronico a scansione ambientale, che consente di osservare campioni idratati a bassa pressione (fino a 2,7 kPa) in un ambiente umido. I microscopi elettronici a scansione sono generalmente più efficienti per i materiali semiconduttori o conduttivi, ma i materiali non conduttivi possono essere elaborati dai microscopi elettronici a scansione ambientale. Una tecnica di preparazione consiste nel rivestire il campione con uno strato di pochi nanometri di materiale conduttivo, come l'oro, da una macchina sputtering, ma questo processo può disturbare i campioni delicati.
Esemplari piccoli e stabili come nanotubi di carbonio , frustoli di diatomee e piccoli cristalli di minerali ( ad esempio fibre di amianto ) non richiedono un trattamento speciale prima di essere esaminati al microscopio elettronico. Per quanto riguarda i campioni di materiali idratati, quasi tutti i campioni biologici devono essere preparati in vari modi per stabilizzarli, ridurne lo spessore (sezioni ultrasottili) e aumentarne il contrasto (colorazione). Questi processi possono portare ad artefatti , ma di solito possono essere identificati confrontando i risultati ottenuti utilizzando metodi di preparazione radicalmente diversi. Gli scienziati che lavorano nel campo generalmente ritengono, dopo aver confrontato i risultati di diverse tecniche di preparazione, che non vi sia alcun motivo per cui producano tutti artefatti simili, e che sia quindi ragionevole ritenere che le immagini fornite dalla microscopia elettronica corrispondano alla realtà del vivere. cellule. Inoltre, i risultati con una risoluzione più elevata sono stati confrontati direttamente con i risultati della cristallografia con raggi X , fornendo una conferma indipendente della validità di questa tecnica. Dagli anni '80 , anche l'analisi di campioni congelati o vetrificati è diventata sempre più utilizzata dagli scienziati, che confermano la validità di questa tecnica.