Il saggio immunoenzimatico ELISA (il saggio inglese immunoassorbente legato all'enzima , letteralmente "tecnica immunoassorbente legato all'enzima", vale a dire, tecnica di supporto solido del saggio immunoenzimatico) è un esame di laboratorio. Questo metodo viene utilizzato principalmente per rilevare la presenza di un anticorpo o di un antigene in un campione .
Questa tecnica di analisi biochimica rientra nel quadro più generale delle tecniche di rilevazione immunoenzimatica (o EIA per saggi immunoenzimatici ), in cui viene seguito il riconoscimento di un antigene studiato da uno specifico anticorpo (o al contrario di un anticorpo studiato da un antigene) da una reazione catalizzata da un enzima che rilascia un componente colorato, la cui quantità viene dosata per spettroscopia . Per fare ciò, l'antigene viene riconosciuto da un anticorpo accoppiato covalentemente a un enzima (o al contrario l'anticorpo viene riconosciuto da un antigene marcato). Il legame della molecola marcata determinerà, dopo l'uso di un substrato cromogenico o fluorogenico per l'enzima legato all'anticorpo, l'emissione di un segnale colorato o fluorescente. Queste tecniche sono da contrapporre ai saggi radioimmunologici (o RIA per i saggi radioimmunologici ) in cui l'etichettatura è effettuata da un radioelemento la cui attività radiologica viene misurata in numero di disintegrazioni al secondo. Per facilitare l'implementazione della tecnica, in particolare nel caso di un numero elevato di campioni da analizzare, l'anticorpo specifico per l'antigene desiderato o l'antigene riconosciuto dall'anticorpo desiderato è legato al supporto utilizzato che ne è ricoperto, da qui il nome di tecnica di immunoassorbimento. Esistono diverse varianti di protocolli operativi che consentono di aumentare la specificità o la sensibilità del riconoscimento dell'antigene (ELISA indiretto, sandwich o competitivo).
Poiché ELISA può essere utilizzato per valutare sia la presenza di un antigene che quella di un anticorpo in un campione, è uno strumento efficace sia per determinare le concentrazioni sieriche di anticorpi (come per il test HIV o il test HIV. Virus del Nilo ), solo rilevare la presenza di un antigene. Ha anche trovato applicazioni nell'industria alimentare, per rilevare allergeni alimentari , come latte , arachidi , frutta a guscio e uova . È un test semplice, facile da usare e poco costoso. È limitato dalla disponibilità di anticorpi specifici.
Per migliorare la sensibilità del rilevamento dell'antigene, l'anticorpo che riconosce l'antigene desiderato può non essere accoppiato a un enzima ma essere riconosciuto specificamente da un secondo anticorpo che sarà esso stesso accoppiato a un enzima .
L'enzima agisce come un potenziatore: anche se si attaccassero pochi anticorpi coniugati all'enzima, l'enzima catalizzerebbe la formazione di molti segnali, il che rende questo test molto sensibile, ma aumenta anche il numero di falsi positivi . È quindi logico prevedere pozzetti di controllo.
I passaggi del cosiddetto ELISA indiretto, il più comunemente utilizzato, per determinare la concentrazione sierica di anticorpi sono:
L'ELISA sandwich è una variante (clinica) meno comune di questa tecnica, utilizzata per rilevare un campione di antigene nel siero o in qualsiasi altro campione. Questa tecnica è invece molto comune nella ricerca.
Il processo si svolge, a grandi linee, come segue:
Tuttavia, come illustrato, molto spesso c'è un passaggio aggiuntivo, l'aggiunta di anticorpi di rilevamento , al fine di evitare la creazione di anticorpi coniugati all'enzima per ciascun antigene . L'uso di un enzima accoppiato che riconosce la frazione Fc di altri anticorpi ne consente l'utilizzo in una varietà di situazioni e riduce il costo della procedura.
Questa variante consente il dosaggio di un antigene utilizzando il principio della competizione vincolante:
Esiste quindi competizione tra gli antigeni marcati (in quantità nota) e non etichettati (in quantità da determinare) per il loro legame agli anticorpi, che mancano. Pertanto, maggiore è il numero di antigeni da analizzare, maggiore è la loro proporzione tra gli antigeni trattenuti dagli anticorpi e più debole sarà il segnale. Al contrario, se la concentrazione iniziale dell'antigene è bassa, il segnale sarà forte.
L'ELISA può essere eseguito per scopi quantitativi o qualitativi:
L'ELISA diretto viene utilizzato per il dosaggio di varie proteine. Alcuni esempi tratti da applicazioni in farmacologia medica: ormoni tiroidei, concentrazione di farmaci (per valutare la compliance e / o aggiustare il dosaggio ), ecc.
L'applicazione più nota al grande pubblico è il test HIV di prima linea .
La tecnica ELISA consente la rilevazione di anticorpi anti- HIV nel siero del sangue (da qui il termine "sieropositivi" o "sieronegativi). La tecnica è altamente sensibile (la maggior parte dei casi vengono rilevati, e" falsi negativi "(= test negativi quando il paziente è sieropositivi) sono quasi da escludere, almeno se il test viene eseguito entro tre mesi dal contatto infettivo) e una specificità accettabile (un basso tasso di " falsi positivi " (= test positivo per reazione dell'anticorpo con un antigene non specifico Tuttavia, in caso di sierologia positiva anti-HIV, i campioni dovrebbero essere sottoposti a test di conferma, come il western blot , che utilizza una tecnica basata sull'elettroforesi e il cui tasso di errore è estremamente basso.