Dicroismo circolare

Diciamo che un materiale presenta un dicroismo circolare se assorbe la luce in modo diverso a seconda che la sua polarizzazione sia circolare destra o circolare sinistra .

La polarizzazione di qualsiasi onda luminosa può essere suddivisa in due parti: una circolare destra (PCD) e l'altra circolare sinistra (PCG). In presenza di dicroismo circolare, uno dei due componenti verrà assorbito più rapidamente dell'altro. Questa proprietà si trova piuttosto nei liquidi e nelle soluzioni a causa della struttura delle molecole . Si presume che questo sia il caso per il resto dell'articolo.

Il fenomeno fu scoperto dal fisico francese Aimé Cotton nel 1896.

Teoria

L' assorbanza del mezzo dicroico ha due valori, associati rispettivamente alle due polarizzazioni circolari: e . Definiamo quindi la differenza tra queste due assorbanze: ${\ displaystyle A_ {G}}$ ${\ displaystyle A_ {D}}$

{\ displaystyle \ Delta A = A_ {G} -A_ {D} \,}

Questa grandezza dipende dalla lunghezza d'onda , cioè dal colore dell'onda luminosa utilizzata.

Possiamo anche esprimere l'uguaglianza di cui sopra usando la legge di Beer-Lambert :

{\ displaystyle \ Delta A = (\ epsilon _ {G} - \ epsilon _ {D}) Cl \,}

dove e sono le rispettive assorbanze molari di PCG e PCD leggeri, C è la concentrazione molare e l è la lunghezza percorsa. ${\ displaystyle \ epsilon _ {G} \,}$ ${\ displaystyle \ epsilon _ {D} \,}$

Definiamo quindi il dicroismo circolare come segue :

{\ displaystyle \ Delta \ epsilon = \ epsilon _ {G} - \ epsilon _ {D} \,}

Tuttavia, la quantità misurata non è direttamente quest'ultima. Infatti, è possibile misurare l' ellitticità solo grazie ai polarizzatori . Questa ellitticità è un angolo corrispondente alla forma della polarizzazione della luce: se la polarizzazione è rettilinea allora , e se la polarizzazione è circolare allora . E man mano che la luce avanza nella soluzione dicroica, la sua forma si avvicina gradualmente a un cerchio. In altre parole, la sua ellitticità si avvicina a 45 °. $\ theta$ ${\ displaystyle \ theta = 0 ^ {\ circ}}$ ${\ displaystyle \ theta = 45 ^ {\ circ}}$

Per mettere in relazione l'ellitticità misurata con il dicroismo circolare, si ricorre ad un'approssimazione molto spesso verificata: supponiamo che l'effetto di questo dicroismo sia debole, cioè . In questo caso, possiamo dimostrare che: ${\ displaystyle \ Delta A \ ll 1}$

{\ displaystyle \ Delta \ epsilon \ propto {\ frac {\ theta} {Cl}}}

E definendo l' ellitticità molare da:

{\ displaystyle [\ theta] = {\ frac {100 \ theta} {Cl}}}

si ottiene la relazione diretta tra la grandezza misurata e il dicroismo circolare:

{\ displaystyle [\ theta] = a \; \ Delta \ epsilon}

con 3298 °

{\ displaystyle a =}

Applicazione a molecole biologiche

In generale, il dicroismo circolare appare in qualsiasi molecola otticamente attiva . Di conseguenza, appare nelle molecole biologiche a causa della loro chiralità . Questo è il caso di alcuni zuccheri e amminoacidi . Anche la loro struttura secondaria gioca un ruolo nel loro dicroismo, in particolare le strutture elicoidali . È quest'ultima proprietà che viene utilizzata in biochimica . Pertanto, le strutture alfa elica e beta fogli delle proteine e la doppia elica degli acidi nucleici mostrano dicroismi circolari caratteristici.

Secondo la meccanica quantistica , il dicroismo circolare è legato alla dispersione della rotazione ottica , cioè al fatto che questa dipende dalla lunghezza d'onda. Mentre quest'ultimo viene misurato lontano dalle bande di assorbimento delle molecole utilizzate, il dicroismo circolare è stato misurato vicino a queste bande. In linea di principio, è possibile passare dall'uno all'altro tramite trasformazioni matematiche.

La distribuzione spettrale del dicroismo circolare fornisce, nel campo dei raggi ultravioletti , importanti informazioni sulla struttura secondaria delle proteine. Ad esempio, questo indica la proporzione della proteina in alfa elica , foglio beta , gomito , bobina casuale , ecc. È anche possibile osservare la denaturazione di una proteina mediante l'aumento del segnale corrispondente alla struttura casuale e la diminuzione dei segnali alfa elica e beta foglio. Si può anche seguire il ripiegamento della proteina (il processo inverso di denaturazione) e determinare quale struttura secondaria si forma per prima (queste sono spesso strutture alfa elicoidali).

Questa informazione permette di ridurre enormemente le possibilità di struttura della proteina studiata, ma non fornisce le posizioni delle strutture secondarie rilevate. Tuttavia, il dicroismo circolare è uno strumento molto efficace per osservare i cambiamenti nelle conformazioni. Ad esempio, può essere utilizzato per mostrare che la struttura secondaria cambia con la temperatura o con la presenza di altre molecole. In questo senso, rivela importanti informazioni sull'aspetto termodinamico della molecola. Può anche essere utilizzato per verificare che la molecola studiata sia effettivamente nel suo stato naturale, o per effettuare altre misurazioni spettroscopiche estranee a queste conformazioni.

Il dicroismo circolare fornisce meno informazioni sulla struttura delle proteine rispetto alla diffrattometria a raggi X o alla proteina NMR , ma consente misurazioni rapide, senza richiedere una grande quantità di proteine e senza complicate analisi dei dati. Pertanto, consente di studiare rapidamente le proteine variando le condizioni del solvente , la temperatura, il pH , la salinità , ecc.

Limitazioni sperimentali

Il dicroismo circolare è stato studiato nei carboidrati , ma con scarso successo a causa delle bande di assorbimento di queste molecole, che si trovano in una regione dell'ultravioletto (100-200 nm ) di difficile accesso.

Un'altra difficoltà è che le soluzioni tampone tipiche spesso assorbono la luce nell'intervallo di pH favorevole al dicroismo circolare. Pertanto, i tamponi fosfato , solfato , carbonato e acetato sono spesso inutilizzabili. Si preferisce quindi utilizzare il borato e i sali di ammonio . Alcuni sperimentatori hanno sostituito, per le stesse ragioni, gli ioni cloruro con gli ioni fluoruro . Alcuni hanno semplicemente lavorato con l'acqua. Ma spesso è necessario utilizzare serbatoi molto fini per limitare questi assorbimenti parassitari. Le lunghezze di 0,1 mm non sono rare.

Gli spettri di dicroismo circolare utilizzati nella rilevazione della struttura secondaria sono legati all'assorbimento tra gli orbitali π e π * dei legami peptidici . Queste bande di assorbimento risiedono in parte nella parte difficile da raggiungere dei raggi UV. Questa parte è inaccessibile all'aria a causa del forte assorbimento di ossigeno in questo intervallo di lunghezze d'onda. In pratica, le misure vengono effettuate utilizzando strumenti riempiti con azoto e senza ossigeno.

Una volta rimosso l'ossigeno, il resto del sistema deve essere ottimizzato per limitare le perdite. Ad esempio, gli specchi dovrebbero essere coperti con alluminio e ottimizzati per l'area desiderata dello spettro (lontano UV).

La normale sorgente di luce in questo tipo di strumento è una lampada a scarica ad alta pressione allo xeno . Questo tipo di lampada non può essere utilizzato nel lontano UV. Lampade fabbricate appositamente devono essere utilizzate con involucri di vetro al quarzo sintetico purissimo. La luce di un sincrotrone è ancora più intensa in quest'area ed è stata utilizzata per eseguire misure di dicroismo circolare fino a lunghezze d'onda dell'ordine di 160 nm.

Riferimenti

Académie des sciences (Francia) Autore del testo , “ Rapporti settimanali delle sessioni dell'Académie des sciences / pubblicato ... da MM. le perpetue segretarie ” , su Gallica ,6 gennaio 1896(accesso 30 maggio 2020 )

Fasman, GD, Circular Dichroism and the Confromational Analysis of Biomolecules (1996) Plenum Press, New York.
Hecht, E., Optics 3a edizione (1998) Addison Wesley Longman, Massachusetts.

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