La reazione a catena della polimerasi ( PCR ) o reazione a catena della polimerasi , generalmente siglé PCR ( dall'inglese : reazione a catena della polimerasi ) o test di amplificazione dell'acido nucleico (NAT Canada francese) è un metodo di amplificazione di geni molecolari in vitro .
Permette di duplicare in gran numero (con un fattore di moltiplicazione dell'ordine di un miliardo) una sequenza nota di DNA o RNA , a partire da una piccola quantità (dell'ordine di pochi picogrammi) di acido nucleotide ( sequenza specifica di DNA ( l' amplicon )) e primer specifici costituiti da oligonucleotidi sintetici da venti a venticinque nucleotidi. Possiamo così, ad esempio, rilevare la presenza dell'HIV o misurare una carica virale (concentrazione del virus nel plasma), tracce di OGM (organismi geneticamente modificati), o virus dell'epatite B, C e D.
Sempre più utilizzati in medicina legale , questa tecnica si basa su una combinazione di due fattori:
Questi elementi consentono di controllare l'attività enzimatica grazie a transizioni di temperatura (fornite da un termociclatore ) ripetute ciclicamente (cfr. reazione a catena ).
Le prime DNA polimerasi utilizzate provenivano da un batterio termofilo (resistente a temperature molto elevate), ad esempio Thermus aquaticus ( Taq polimerasi ) o anche Pyrococcus furiosus (Pfu polimerasi), Thermococcus litoralis (Vent o Tli polimerasi), Thermus thermophilus (Tth polimerasi) . Oggigiorno, gli enzimi utilizzati sono detti ricombinanti , il che ne semplifica notevolmente la produzione, e le loro proprietà sono state ampiamente modificate per renderli più efficienti e fedeli.
In meno di dieci anni abbiamo imparato a fare più di un miliardo di copie in meno di un'ora, cosa che ha imposto la PCR nei laboratori rivoluzionando la biologia molecolare. Tuttavia, non è affidabile per alcune fonti di campione ( urina , espettorato ), probabilmente a causa degli inibitori della Taq polimerasi .
La PCR è una tecnologia che ha rivoluzionato la biologia molecolare e si è affermata molto rapidamente nei laboratori. Al contrario, la PCR in tempo reale ha dovuto attendere l'arrivo sul mercato di una serie di innovazioni tecnologiche prima di svilupparsi ed è ancora considerata una nuova metodologia. Il numero di articoli all'anno che rispondono alle parole chiave " reazione a catena della polimerasi " (1) e " reazione a catena della polimerasi in tempo reale " (2) sul motore di ricerca PubMed dà un'idea abbastanza buona della loro importanza nel mondo scientifico. Si noti che il metodo non è esente da bias, ad esempio alcuni articoli per PCR in tempo reale si trovano nel 1991 e nel 1992 (linea tratteggiata) mentre il suo principio è stato descritto solo nel 1993. La differenza (1 -2) è rappresentativa del peso del punto finale della PCR , che probabilmente gradualmente cedere il passo al tempo reale.
Questa tecnica si è notevolmente evoluta sin dal suo inizio. Tra le modifiche più fondamentali troviamo:
Per chiarezza le date corrispondono alla prima pubblicazione sul campo e vengono citati solo i primi autori, i riferimenti completi sono nel capitolo “Bibliografia”. Questa scelta permette anche di limitare le controversie come il ruolo di Rosalind Elsie Franklin nella scoperta della struttura della doppia elica del DNA.
La PCR è una tecnica basata su una ripetizione di cicli di transizione di temperatura. Fatta eccezione per alcune metodologie (es. l'uso di sonde di idrolisi), ogni ciclo contiene tre fasi descritte di seguito. Per motivi didattici, considereremo per il seguente esempio un'efficienza della PCR del 100%.
Questo passaggio viene generalmente eseguito a temperatura ambiente. Il DNA a doppio filamento adotta la sua conformazione a doppia elica. In questo esempio considereremo che nella soluzione c'è solo una molecola iniziale di DNA a doppio filamento, l'area colorata (rosa e arancione) corrispondente al nostro amplicone. Nota: i DNA complementari risultanti dalla trascrizione inversa sono generalmente a singolo filamento e quindi adotteranno conformazioni tridimensionali complesse simili a quelle degli RNA.
Denaturazione iniziale (1' sul diagramma)Prima di iniziare i cicli di PCR veri e propri, viene eseguita una fase di riscaldamento (generalmente da 10 a 15 minuti a 95 °C ). Questa fase consente di: deibridare i DNA a doppia elica, rompere le strutture secondarie, omogeneizzare il mezzo di reazione mediante agitazione termica, attivare le polimerasi di tipo “Hot start”, denaturare altri enzimi eventualmente presenti nella soluzione ( trascrittasi inversa, uracile-N-glicosilasi).
Fase di denaturazione (1 sul diagramma)Questo passaggio (generalmente da 0 a 1 minuto a 95 °C. ) permette di deibridare i DNA, di “staccare” le polimerasi che sarebbero ancora legate ad una matrice e di omogeneizzare il mezzo di reazione.
Fase di ibridazione o accoppiamento dei primer (2 nel diagramma)Questo passaggio (generalmente da 2 a 60 secondi a 56 - 64 °C ) consente ai primer senso e antisenso di ibridarsi a DNA stampo grazie a una temperatura termodinamicamente favorevole. Pochi dei filamenti di DNA stampo possono ibridarsi (legarsi) con il loro filamento complementare, il che impedirebbe il legame dei primer, poiché i primer sono molto più corti e in concentrazione molto più elevata. Sperimentalmente si osserva che la PCR funziona anche con una fase di ibridazione con una temperatura di qualche grado superiore alla Tm teorica dei primer, probabilmente perché già interagiscono con le polimerasi, che stabilizzerebbero la loro ibridazione al DNA stampo.
Caratteristiche dei primerQuesto passaggio (generalmente da 4 a 120 secondi a 72 °C. ) consente alle polimerasi di sintetizzare il filamento complementare del loro DNA stampo ad una temperatura per loro ottimale. Questo filamento è costituito da dNTP liberi presenti nel mezzo di reazione. La durata di questo passaggio normalmente dipende dalla lunghezza dell'amplicone.
Alla fine del passaggio 3, abbiamo quindi due filamenti di DNA stampo e due filamenti (un senso e uno antisenso) di DNA definiti con precisione solo alla loro estremità 5'.
Ciclo n ° 2Le tre fasi procedono come nel ciclo n ° 1, tranne per il distacco spontaneo di due polimerasi che hanno raggiunto la fine del loro DNA stampo. Alla fine della fase 3, otteniamo tutti i tipi di DNA che esisteranno durante la PCR, ovvero:
Idem per il ciclo 2. Alla fine della fase 3, osserviamo 1 filamento di tipo A e F, 3 di B e D e 4 di C ed E. Osserviamo la comparsa di due molecole di DNA a doppio filamento CE. al nostro amplicone.
Ciclo n ° 4Idem per il ciclo 3. Alla fine della fase 4, osserviamo 1 filamento di tipo A e F, 4 di B e D e 11 di C ed E. Osserviamo che l'amplicone diventa la combinazione maggioritaria.
Cicli n . 5 e oltreSe avessimo aumentato il numero di cicli, avremmo ottenuto la seguente tabella:
cicli | ||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | non | ||
tipo di molecole | A | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
B | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
VS | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
D | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
E | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
F | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
singolo filo | numero | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | 65536 | Da A n a F n |
% amplicon | 0.00 | 0.00 | 25.00 | 50.00 | 68.75 | 81.25 | 89.06 | 93.75 | 96.48 | 98.05 | 98,93 | 99,41 | 99.68 | 99,83 | 99,91 | 99,95 | ||
doppio filo | numero | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | |
% amplicon | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 12.50 | 43.75 | 65.63 | 79.69 | 88.28 | 93.36 | 96.29 | 97,95 | 98,88 | 99.39 | 99,67 | 99.82 | 99,91 |
dove A n (B n , ecc.) è il numero di molecole di tipo A (B, ecc.) presenti dopo l' ennesimo ciclo.
Analizzando questa tabella troviamo che:
Questi valori sono stati ottenuti partendo da una singola molecola iniziale di DNA a doppia elica, ma altrimenti ogni stampo avrebbe subito lo stesso processo. Ad un dato ciclo, la quantità di DNA dipende quindi dal numero iniziale di matrici. D'altra parte, qualunque sia la sua concentrazione iniziale, è teoricamente possibile ottenere qualsiasi quantità regolando il numero di cicli. La PCR è quindi teoricamente disciplinata dalla legge:
Ma la PCR è una reazione enzimatica complessa. Il prodotto è identico al substrato e può arrivare ad inibire l'enzima, ma soprattutto i reagenti secondari (primer, dNTP) possono iniziare a mancare. La PCR può quindi avere una legge di amplificazione esponenziale solo se il DNA stampo è l'unico fattore limitante . La reazione diventa quindi imprevedibile ed è quindi impossibile poter confrontare più campioni tra loro senza un bias quantitativo più o meno significativo (si veda l'articolo sulla PCR quantitativa ). È quindi importante comprendere le diverse fasi della cinetica della PCR.
Questo capitolo tratta della cinetica misurabile di una PCR, poiché i limiti tecnologici rendono inaccessibili i primi cicli, e generalmente gran parte della parte esponenziale. Il suo profilo apparente (misurabile) adotta diverse fasi distinte, più o meno sviluppate secondo scelte metodologiche.
NB : Il termine efficacia può avere due significati secondo gli autori:
Le conclusioni tratte da questi due concetti (che si possono dedurre direttamente l'uno dall'altro) sono assolutamente identiche; per la trattazione successiva conserveremo la prima definizione, maggioranza. Questa efficienza della PCR è un elemento fondamentale da tenere in considerazione quando si ottiene una misurazione quantitativa o si stabilisce un protocollo PCR multiplex, ma è generalmente trascurabile per un risultato di PCR qualitativo o end-point .
Nel caso di un ciclo teorico perfetto, ogni filamento modello fornisce una e una sola copia completa dell'amplicone. Il numero totale di filamenti quindi raddoppia ad ogni passaggio, e l'efficienza teorica di una reazione di PCR (indicata con E ) è, in questo caso, esattamente uguale a due. Nel grafico che dà il risultato in un benchmark semi-logaritmico , ciò si traduce nel fatto che la pendenza della parte rettilinea corrisponde ad una progressione ideale di log (2) per ciclo (cioè circa 3 decibel per ciclo).
L'avvento della PCR in tempo reale ha evidenziato che l'effettiva efficienza della reazione non era sempre uguale a due. Ciò significa che su tutti i cicli considerati quantitativi (area n o 6 cinetica) nelle condizioni reali di replicazione, un filamento non può dare una copia e un singolo. Nel grafico di riferimento semi-logaritmico, ciò si traduce in una pendenza del lato destro diversa dalla pendenza prevista e generalmente meno ripida. La pendenza sperimentale è misurabile e fornisce il valore sperimentale di E . Il fatto che questa parte sia diritta significa che in questo intervallo di concentrazione, il numero medio di copie prodotte da un filamento è costante da un ciclo all'altro (e in particolare, non dipende dalle concentrazioni). Ma non c'è, in questo caso, "una copia e una sola per ciocca", bensì un numero diverso.
La maggior parte dei protocolli sperimentali fornisce un'efficienza della PCR compresa tra 1,75 e 2. Due fenomeni sono le cause principali, e portano ad un'efficienza sperimentale inferiore o uguale a due, poiché le reazioni biochimiche non sono sempre totali, alcune repliche falliscono in condizioni sperimentali reali condizioni:
Al contrario, alcune fonti ritengono che possa anche essere maggiore di due (il che presuppone che un filamento abbia una probabilità significativa di eseguire due o più sintesi durante un ciclo) e sarebbe accettabile fino a 2.3. Si può spiegare in due modi:
Due scuole poi si scontrano, sostenendo argomentazioni sperimentali. Si considera che questa efficienza sia una costante per ogni amplicone in un dato protocollo sperimentale. L'altro ritiene che vari sempre in modo significativo e che debba essere costantemente rimisurato. Va notato che è molto difficile sapere se una variazione nell'efficienza della PCR osservata derivi dalla natura stessa di questo metodo, da una variazione nel protocollo sperimentale (mancanza di riproducibilità dei reagenti o manipolazione) o da una variazione dei dati acquisizione (variazioni di fluorescenza, differenti canali di lettura, bias nell'analisi matematica). È anche molto difficile essere certi che l'efficienza utilizzata (misurata in ogni esperimento o meno) sia effettivamente quella avvenuta nel campione da calibrare (vedi PCR quantitativa ).
Acronimi e nomi in inglese sono riportati tra parentesi.
Multiplex PCR ( multiplex PCR ) è un protocollo per amplificare più di un amplicone alla volta, mediante l'uso di almeno tre reazioni di PCR primer. I prodotti della PCR saranno quindi competitivi solo per la polimerasi, i dNTP e, facoltativamente, il marcatore del DNA. È anche possibile amplificare diversi tipi di DNA riconosciuti dalla stessa coppia di primer, come i mimici. La multiplex PCR può essere eseguita al punto finale (i prodotti della PCR sono solitamente differenziati per la loro dimensione o per la presenza di un sito di restrizione) o in tempo reale (ogni prodotto viene misurato da una sonda specifica accoppiata a un fluoroforo il cui spettro di emissione è diverso da altri). Le sue applicazioni qualitative sono numerose (rilevamento di ceppi virali, mutazioni, ecc.) ma il suo aspetto quantitativo non è unanime, nonostante la forte pressione industriale per questo mercato molto redditizio.
La meta-PCR è un metodo che consente di fornire una molecola di DNA sintetica comprendente qualsiasi combinazione di DNA amplificabile mediante PCR in qualsiasi ordine. Viene eseguito in un unico tubo e consiste in due diverse fasi della PCR separate da un ciclo di scongelamento per rimuovere l'attività residua della polimerasi. La meta-PCR può essere utilizzata per aumentare il rendimento dei metodi di scansione e scansione delle mutazioni.
La nested PCR , PCR pull o nested PCR ( nested PCR ) è una PCR in due fasi successive, con due diverse coppie di primer, le seconde sequenze di legame situate all'interno del primo amplicone. Questa tecnica è stata inizialmente utilizzata per ridurre il rischio di contaminazione (il prodotto finale doveva poter interagire con due coppie di primer, quindi due livelli di specificità). Ora è ampiamente utilizzato dai virologi che lavorano su virus a RNA che possono avere un'elevata mutabilità. La prima coppia di primer è progettata per poter agganciare le poche parti stabili del genoma virale, la seconda per identificare il sottotipo. Consente inoltre una migliore sensibilità del risultato.
È l'amplificazione PCR in presenza di una piccola quantità di uno dei primer. Consente il sequenziamento diretto dei frammenti amplificati. Durante i primi 20-25 cicli, viene generato DNA a doppio filamento, fino all'esaurimento del primer limitante e durante gli ultimi 5-10 cicli viene prodotto DNA a filamento singolo. I rapporti dei primer utilizzati sono 50 pmol / 1-5 pmoli / 100 µl (1-3 pmoli a singolo filamento dopo 30 cicli).
La PCR termica interlacciata asimmetrica ( TAIL-PCR o PCR interlacciata termica asimmetrica ) è un protocollo complesso che combina i principi della PCR annidata, della PCR asimmetrica per la Tm dei primer, la successione di diversi tipi di ciclo favorendo l'ibridazione di tale e tale primer e primer degenerati. Lo scopo è quello di ottenere un amplicone finale specifico per una sequenza di DNA di cui è generalmente nota solo un'estremità al fine di sequenziare la parte sconosciuta. Questo metodo è ampiamente utilizzato per la camminata cromosomica o la caratterizzazione di sequenze variabili di immunoglobuline.
Questa è una tecnica che aiuta lo sviluppo di un nuovo protocollo PCR. Richiede termociclatori in grado di garantire temperature diverse, per lo stesso passaggio, per i diversi campioni. Viene principalmente utilizzato per ottimizzare la fase di ibridazione, in particolare in multiplex PCR.
La PCR semiquantitativa si basa sull'interruzione della PCR in più cicli corrispondenti alla fase stazionaria (la quantità di DNA aumenta molto lentamente poiché c'è poco DNA stampo), alla fase esponenziale (crescita rapida) e al plateau (diminuzione nella quantità di reagenti). Per un campione è possibile stimare la quantità iniziale di DNA se esiste un campione di cui è nota la quantità (standard). La loro amplificazione mediante PCR, l'arresto della reazione tra il 20 ° e il 30 ° ciclo di PCR e il confronto delle intensità luminose dei prodotti di PCR marcati BET consentono di stimare la quantità iniziale di DNA. Per due campioni, è possibile confrontare la quantità di DNA iniziale interrompendo la PCR prima del plateau PCR (<30 cicli).
PCR in tempo reale o PCR quantitativaLa real-time PCR ( Real-time PCR ) è una rivoluzione nell'uso della PCR, questa tecnica consiste nel misurare la quantità di DNA polimerizzato in ogni ciclo (real time) con un'etichetta fluorescente . Consente per il suo principio di effettuare misurazioni quantitative (spiegando il nome PCR quantitativa, qPCR ) ma richiede termociclatori speciali . Non deve essere confuso con RT-PCR ( Reverse Transcription PCR ), quindi preferiamo i nomi PCR quantitativa o qPCR . Alcuni esperimenti di PCR competitiva o PCR radioattiva consentono di ottenere misurazioni quantitative sfruttabili.
PCR dell'endpointIl punto finale della PCR ( end-point PCR ) è un termine emerso in opposizione alla PCR in tempo reale . Si riferisce a tutti i tentativi di quantificazione dal prodotto finale di una reazione PCR.
La reazione a catena della polimerasi touchdown ( Touchdown PCR ) è un protocollo utilizzato per amplificare DNA scarsamente rappresentato e/o sottoposto a competizione sui propri primer da parte di prodotti pseudogeni. Consiste nell'avere una temperatura di ibridazione molto elevata durante i primi cicli in modo da garantire un'elevata stringenza e quindi un'amplificazione specifica. Una volta che la sequenza di interesse diventa maggioritaria rispetto ai suoi concorrenti, la temperatura di ibridazione viene gradualmente abbassata al fine di garantire una migliore efficienza della PCR. L'efficienza non è costante per tutta la reazione, non è possibile, ad oggi, essere in grado di ottenere un risultato quantitativo senza bias.
La colony PCR ( Colony PCR ) è un protocollo per amplificare un modo semplice di DNA di microrganismi (batteri, archaea o lieviti) inoculando direttamente la colonia nella miscela di reazione della PCR. Durante le prime fasi della denaturazione, le cellule vengono lisate e il loro DNA viene rilasciato nel mezzo di reazione. Il DNA così rilasciato può quindi fungere da stampo.
La colony PCR viene utilizzata in particolare per verificare l'efficienza di una transgenesi. È stato ampiamente utilizzato durante la costruzione di BAC in grandi programmi di sequenziamento .
Colony PCR è ampiamente utilizzato nella ricerca microbiologica al fine di caratterizzare filogeneticamente i ceppi studiati.
L'ep-PCR consente di introdurre errori nella sequenza copiata dalla polimerasi. Questa tecnica può essere utilizzata ad esempio per creare un gran numero di mutanti che verranno poi selezionati (evoluzione diretta). La polimerasi utilizzata (la Taq polimerasi è naturalmente meno fedele delle polimerasi convenzionali in PCR) e condizioni particolari (alte concentrazioni di MgCl 2 o aggiunta di MnCl 2 ) consentono di aumentare il tasso di errori.
La RT-PCR ( reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi ) è una tecnica che combina la trascrizione inversa (RT) seguita dalla PCR. Sintetizza il filamento complementare di un RNA con desossiribonucleotidi utilizzando una DNA polimerasi RNA dipendente ( trascrittasi inversa ). Questo cDNA è generalmente destinato ad essere amplificato mediante PCR (il cDNA essendo più stabile, consente una maggiore libertà rispetto agli RNA per le analisi successive).
Utilità: viene utilizzato per la diagnosi clinica, tramite misurazioni quantitative mediante real-time PCR (studio delle cariche virali nei virus a RNA) e tramite misurazioni qualitative (analisi del prodotto di espressione genica). Può anche facilitare il sequenziamento di geni di grandi dimensioni.
La trascrizione inversa rimane delicata (bassa riproducibilità; fragilità dell'RNA, frequente contaminazione da DNA. Talvolta è necessaria un'amplificazione specifica (se il terreno contiene sequenze omologhe in quantità molto maggiori di quelle della sequenza di interesse). La scelta di primer per PCR e il rispetto degli standard interni o esterni è spesso di grande importanza.
RT-PCR in un solo passaggioIl passaggio a RT-PCR ( RT-PCR a passaggio singolo ) è un protocollo che mescola i reagenti RT e PCR in modo che entrambi i passaggi possano essere eseguiti senza dover aprire la provetta. Ciò consente di ridurre il rischio di contaminazione o inversione del campione, ma è più difficile ottimizzare il mezzo di reazione per ogni fase. Ciò induce ulteriormente un rischio di bias per normalizzare la fase RT perché comporta l'uso di multiplex PCR.
RT-PCR in situLa RT-PCR in situ è una metodologia che consiste nell'effettuare la RT-PCR non su molecole in soluzione ma su sezioni istologiche. Sebbene i risultati siano solo semi-quantitativi, forniscono anche informazioni sulla posizione delle trascrizioni nel tessuto.
RT-PCR quantitativaLa RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) è una tecnica per poter quantificare un tipo di RNA originariamente presente in un campione. Questo termine designa l'uso di due tecniche in successione, trascrizione inversa seguita da PCR in tempo reale. Obiettivo principale della maggior parte dei biologi, solleva vivaci controversie sull'uso di calibratori esterni o interni (gene di famiglia). Ad eccezione di protocolli complessi che utilizzano calibratori esterni omologhi competitivi, consente solo la quantificazione relativa.
RT-PCR su una cellulaLa RT-PCR a cella singola ( RT-PCR a cella singola ) è una metodologia utilizzata per studiare i trascritti di una singola cellula, ottenuti mediante patch-clamp, microdissezione laser o cernita cellulare per attività di fluorescenza (FACS in inglese per Fluorescence Activated cell sorting ). Questa precisione può essere necessaria quando il tessuto non è omogeneo (cellule tumorali, strati cellulari ben differenziati, ecc.) ma la quantificazione diventerà meno precisa a causa di un'amplificazione degli effetti stocastici e quindi richiederà una moltiplicazione delle misurazioni.
Un'altra tecnica di amplificazione isotermica: "polimerizzazione di acidi nucleici per apoptosi controllata". Gli autori affermano che questa tecnica potrebbe essere implementata nelle cellule viventi, e quindi trattare varie patologie (HIV, malaria, tumori, ecc.) ma queste affermazioni non sono state confermate da nessun altro team per il momento.
TP-PCR (TP sta per Triplet Repeat primerd ), una variante complessa della PCR, è stata sviluppata da Jon Warner nel 1996 ed è utilizzata nelle amplificazioni di geni con triplette ripetute, come nel caso della Distrofia Miotonica di Steinert . La combinazione PCR- sequencing non può essere utilizzata in questi casi perché la Taq polimerasi commette errori di replicazione.
L' amplificazione elicasi-dipendente ( amplificazione elicasi-dipendente , HDA ) è una tecnica recente vicina alla PCR, dove la deibridazione indotta dalla temperatura è fornita da un'elicasi.
La PCR consente una diagnosi rapida e altamente specifica di malattie infettive causate da batteri o virus. La PCR consente anche l'identificazione di microrganismi non coltivabili oa crescita lenta come micobatteri , batteri anaerobi o virus da saggi di coltura tissutale e modelli animali. La base delle applicazioni diagnostiche della PCR in microbiologia è la rilevazione di agenti infettivi e la discriminazione di ceppi non patogeni da ceppi patogeni sulla base di geni specifici.
La caratterizzazione e il rilevamento di organismi infettivi sono stati rivoluzionati dalla PCR come segue:
Il virus dell'immunodeficienza umana (o HIV ) è un bersaglio difficile da trovare ed eradicare. I primi test per l'infezione si basavano sulla presenza di anticorpi contro il virus nel sangue. Tuttavia, gli anticorpi non compaiono fino a diverse settimane dopo l'infezione, gli anticorpi materni mascherano l'infezione di un neonato e gli agenti terapeutici per combattere l'infezione non influenzano gli anticorpi. I test PCR sono stati sviluppati per essere in grado di rilevare basse cariche virali dell'ordine di un genoma virale nel DNA di oltre 50.000 cellule ospiti. Le infezioni possono essere rilevate prima, il sangue donato può essere esaminato direttamente per il virus, i neonati possono essere immediatamente testati per l'infezione e gli effetti dei trattamenti antivirali possono essere quantificati.
Alcuni organismi patogeni, come la tubercolosi , sono difficili da raccogliere dai pazienti e lenti a svilupparsi in laboratorio. I test basati sulla PCR possono rilevare un piccolo numero di organismi patogeni (vivi o morti) nei campioni. L'analisi genetica dettagliata può essere utilizzata anche per rilevare la resistenza agli antibiotici, consentendo un trattamento immediato ed efficace. Anche gli effetti della terapia antibiotica possono essere immediatamente valutati.
La diffusione di un organismo patogeno attraverso popolazioni di animali domestici o selvatici può essere monitorata mediante test PCR. In molti casi, è possibile rilevare e monitorare la comparsa di nuovi sottotipi virulenti. I sottotipi di un organismo che erano responsabili di precedenti epidemie possono anche essere determinati mediante PCR.
Il DNA virale può essere rilevato mediante PCR. I primer utilizzati devono essere specifici per le sequenze bersaglio nel DNA di un virus e la PCR può essere utilizzata per saggi diagnostici o per il sequenziamento del DNA del genoma virale. L'elevata sensibilità della PCR consente di rilevare il virus subito dopo l'infezione e anche prima dell'insorgenza dei sintomi della malattia. Tale diagnosi precoce può offrire ai medici una scelta più ampia di trattamento. La quantità di virus ( carica virale ) in un paziente può essere quantificata anche mediante tecniche di quantificazione del DNA basate sulla PCR. Ad esempio, una variante della PCR (RT-PCR) viene utilizzata per rilevare il genoma virale della malattia di Coronavirus 2019 .
Malattie come la pertosse sono causate dal batterio Bordetella pertussis. Questo batterio provoca una grave infezione respiratoria acuta che colpisce vari animali e esseri umani e provoca la morte di molti bambini piccoli. La tossina della pertosse è un'esotossina proteica che si lega ai recettori cellulari mediante due dimeri e reagisce con diversi tipi di cellule come i linfociti T che svolgono un ruolo nell'immunità cellulare. La PCR è un importante strumento di test in grado di rilevare le sequenze nel gene della tossina della pertosse. Poiché la PCR ha un'elevata sensibilità alle tossine e tempi di risposta rapidi, è molto efficace nella diagnosi della pertosse rispetto alla coltura.