Unità formante colonie

In microbiologia , un'unità formante colonia/unità formante colonia ( CFU ) è un'unità utilizzata per stimare il numero di batteri vitali o cellule fungine in un campione. La sostenibilità è definita come la capacità di moltiplicarsi attraverso la fissione binaria in condizioni controllate. Il conteggio con le unità formanti colonie richiede la coltura dei microrganismi e conta solo le cellule vitali, a differenza di altre analisi come la microscopia a epifluorescenza o la citometria a flusso che conta tutte le cellule, vive o morte. L'aspetto visivo di una colonia in una coltura cellulare richiede una crescita significativa e quando si contano le colonie non è certo che la colonia abbia avuto origine da una singola cellula (potrebbe provenire da un gruppo di cellule). Esprimere i risultati come unità formanti colonie riflette questa incertezza.

Teoria

Lo scopo del conteggio su agar è stimare il numero di cellule presenti in base alla loro capacità di dare origine a colonie in condizioni specifiche di mezzo nutritivo, temperatura e tempo. In teoria, una cellula vitale può dare origine a una colonia per replicazione. Tuttavia, le cellule solitarie sono un'eccezione in natura e la colonia può provenire da una massa di cellule depositate insieme o fisicamente vicine tra loro. Inoltre, molti batteri crescono in catene (come Streptococcus ) o in grappoli (come Staphylococcus ). La stima del numero di cellule contando le CFU, nella maggior parte dei casi, sottostimerà il numero di cellule viventi presenti in un campione per questi motivi. Infatti, il conteggio delle CFU presuppone che ogni colonia sia separata e fondata da una singola cellula microbica vitale.

Per E. coli , il conteggio è lineare su un intervallo da 30 a 300 CFU su una piastra Petri di dimensioni standard. Pertanto, per garantire che un campione produca CFU all'interno di questo intervallo, il campione deve essere diluito e diluizioni multiple distribuite su più piatti. Di solito vengono utilizzate diluizioni 1/10 e la serie di diluizioni viene distribuita in 2 o 3 repliche nell'intervallo di diluizione prescelto. L'UFC/lastra viene letta da una lastra nell'intervallo lineare, quindi si deduce matematicamente l'UFC/g (o CFU/mL) dell'originale, tenendo conto della quantità di lastra e del suo fattore di diluizione.

Un vantaggio di questo metodo è che specie microbiche diverse possono dare origine a colonie nettamente diverse tra loro, sia microscopicamente che macroscopicamente. La morfologia della colonia può essere di grande aiuto nell'identificazione del microrganismo presente .

Una precedente comprensione dell'anatomia microscopica dell'organismo può fornire una migliore comprensione di come le CFU/ml osservate si riferiscono al numero di cellule vitali per millilitro. In alternativa, in alcuni casi è possibile ridurre il numero medio di cellule per CFU agitando il campione prima di eseguire la diluizione. Tuttavia, molti microrganismi sono delicati e sperimenterebbero una diminuzione della proporzione di cellule vitali poste in un vortice.

Notazione logaritmica

Le concentrazioni delle unità formanti colonia possono essere espresse utilizzando la notazione logaritmica, dove il valore indicato è il logaritmo in base 10 della concentrazione. Ciò consente di calcolare la riduzione logaritmica di un processo di decontaminazione come una semplice sottrazione.

Usi

Le unità formanti colonie sono utilizzate in microbiologia per quantificare i risultati in molti metodi di conteggio e piastratura dell'agar, tra cui:

Tuttavia, con tecniche che richiedono l'uso di una piastra con agar, non è possibile utilizzare alcuna soluzione fluida poiché non è possibile identificare la purezza del campione e non è possibile contare le cellule una per una nel liquido.

Strumenti per contare le colonie

Il conteggio delle colonie viene tradizionalmente eseguito manualmente utilizzando una penna e un contatore di clic. Questo è di solito un compito semplice, ma può diventare molto laborioso e richiedere molto tempo quando ci sono molte placche da contare. In alternativa si possono utilizzare soluzioni semiautomatiche (software) e automatiche (hardware + software).

Software di conteggio CFU

Le colonie possono essere contate dalle immagini dei piatti analizzate dal software. Gli sperimentatori in genere scattano una foto di ogni lastra che devono contare, quindi analizzano tutte le immagini (questo può essere fatto con una semplice fotocamera digitale o anche una webcam). Poiché occorrono meno di 10 secondi per scattare una singola foto, invece di diversi minuti per contare manualmente le PDU, questo approccio di solito consente di risparmiare molto tempo. Inoltre, è più oggettivo e consente di estrarre altre variabili come la dimensione e il colore delle colonie.

Ecco tre esempi:

Oltre al software basato su computer desktop tradizionali, sono disponibili applicazioni per dispositivi Android e iOS per il conteggio delle colonie semiautomatico e automatizzato. La fotocamera integrata viene utilizzata per scattare foto della piastra di agar e viene utilizzato un algoritmo interno o esterno per elaborare i dati dell'immagine e stimare il numero di colonie.

Sistemi automatizzati

Molti sistemi automatizzati vengono utilizzati per contrastare l'errore umano perché molte delle tecniche di ricerca eseguite dall'uomo per contare le singole cellule comportano un alto rischio di errore. Poiché i ricercatori contano regolarmente manualmente le cellule utilizzando la luce trasmessa, questa tecnica soggetta a errori può avere un effetto significativo sulla concentrazione calcolata nel mezzo liquido principale quando le cellule sono piccole.

Alcuni produttori di biotecnologie offrono anche sistemi completamente automatizzati. Sono generalmente costosi e non flessibili come il software autonomo perché l'hardware e il software sono progettati per funzionare insieme per una configurazione specifica . In alternativa, alcuni sistemi automatici utilizzano il paradigma dell'impiallacciatura a spirale.

Alcuni dei sistemi automatizzati come quelli di MATLAB consentono di contare le cellule senza doverle macchiare. Ciò consente di riutilizzare le colonie per ulteriori esperimenti senza il rischio di uccidere i microrganismi macchiati. Tuttavia, uno svantaggio di questi sistemi automatizzati è che è estremamente difficile differenziare i microrganismi con polvere o graffi su piastre di agar sangue, poiché polvere e graffi possono creare una combinazione molto diversa di forme e aspetti.

Unità alternative

Invece delle unità formanti colonia, è possibile utilizzare i parametri Numero più probabile (MPN) e Unità pesce modificate (MFU). Il metodo del numero più probabile conta le cellule vitali ed è utile quando si enumerano basse concentrazioni di cellule o si enumerano microbi in prodotti in cui le particelle rendono impraticabile il conteggio delle piastre. Le unità Fishman modificate tengono conto di batteri vitali ma non coltivabili.

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Vedi anche

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