Tecniche di biologia molecolare

Principali tecniche comunemente utilizzate in biologia molecolare :

Elettroforesi

Elettroforesi su gel : questa tecnica permette di separare le molecole in base alla loro dimensione (chiamata peso molecolare) facendole migrare attraverso un gel applicando un campo elettrico. La corrente spinge le molecole e le maglie del gel le rallentano. La loro migrazione dipende quindi sia dalla loro dimensione ma anche dalla concentrazione del gel; andranno anche oltre in quanto sono piccoli e il gel meno concentrato. Questa tecnica può essere utilizzata per separare DNA , RNA ( gel di agarosio o acrilammide ) o proteine (gel di acrilammide).
Elettroforesi su gel a gradiente denaturante .
Elettroforesi capillare : una variante dell'elettroforesi utilizzata per il sequenziamento del DNA.

Digestione enzimatica (digestione di restrizione ): tecnica che utilizza enzimi di restrizione per tagliare specificamente una molecola di DNA al fine di manipolarla o clonarla.

Miniprep o miniprep: tecnica per estrarre una piccola quantità di DNA plasmidico da batteri trasformati .

A seconda della quantità di DNA desiderata vengono utilizzati anche preparati midi o maxi-preparati.

Clonazione : tecnica che consiste nell'isolare un frammento di DNA e moltiplicarlo in modo identico "inserendolo" in una molecola di DNA "vettore" chiamata vettore che ne consente l'amplificazione e si ottiene infine una molecola di DNA ricombinante

Mutagenesi sito-diretta : tecniche che consentono di modificare in modo preciso e puntuale le basi di un genoma.

Reazione a catena della polimerasi : Polymerase Chain Reaction (PCR). Questa tecnica viene utilizzata per amplificare il DNA, cioè per ottenere una grande quantità di copie di una data sequenza nucleotidica.

RT-PCR può avere due significati distinti:
- PCR in tempo reale PCR in tempo reale.
- Trascrizione inversa: PCR della trascrittasi inversa. Questa tecnica è la combinazione della trascrizione inversa di un RNA e di una PCR e che consente di clonare la fase codificante di un gene o di quantificarne il livello di trascrizione (quantità di RNA presente).

Amplificazione casuale del polimorfismo del DNA : amplificazione casuale del DNA polimorfico (RAPD). Tecnica di amplificazione casuale per confrontare i DNA genomici.

Sequenziamento del DNA : una tecnica per definire l'ordine dei nucleotidi di un frammento di DNA plasmidico o genomico.

I diversi metodi di sequenziamento:

- Metodo o metodo chimico di Maxam e Gilbert;
- Metodo enzimatico o metodo Sanger.
- il pirosequenziamento

Southern blotting : tecnica che utilizza l'elettroforesi su gel e consente la rilevazione di particolari sequenze di DNA. Utilizzato frequentemente in biologia molecolare per rilevare il numero di copie di transgeni inseriti nel genoma di una cellula o organismo geneticamente modificato.

Northern blotting : tecnica derivata dal Southern blotting utilizzata per rilevare e quantificare un dato tipo di RNA.

L' etichettatura degli acidi nucleici .
Trasformazione genetica o transgenesi : tecnica che consiste nell'introdurre uno o più geni nelle cellule (ad esempio vegetale, animale, batterico) portando alla trasmissione del gene introdotto, o transgene , alle generazioni successive.
Il frammento di restrizione del polimorfismo di lunghezza (o RFLP): Studio tecnico del polimorfismo genetico alla base del "DNA" e della "ribotipizzazione".
L' ibridazione in situ fluorescente ( ibridazione in situ fluorescente inglese o FISH)
Semplice ibrido
Doppio ibrido
Saggio di complementazione proteica PCA

Western blotting : tecnica derivata dal Southern blotting utilizzata per rilevare e quantificare un dato tipo di proteina.
Sequenziamento delle proteine : una tecnica per definire l'ordine degli amminoacidi in una sequenza polipeptidica.
Metodo TAP o TAP-TAG, tecnica di purificazione del complesso proteico.