Il pirosequenziamento è una tecnica di sequenziamento del DNA che consente un sequenziamento rapido e più economico del sequenziamento con metodo Sanger . Questa tecnica infatti non necessita di clonazione (risparmiando così tempo e denaro), e permette la lettura diretta della sequenza ottenuta dopo il sequenziamento. Si basa sul principio del "sequenziamento per sintesi", in cui il sequenziamento viene effettuato rilevando il nucleotide incorporato da una DNA polimerasi . Il pirosequenziamento si basa sulla rilevazione, mediante quantificazione della luce emessa, del pirofosfato rilasciato durante la reazione a catena, da cui il nome pirosequenziamento.
Il principio del pirosequenziamento è stato affermato per la prima volta nel 1993 da Pettersson, Uhlen e Nyren combinando la fase solida del sequenziamento utilizzando sfere magnetiche avvolte in streptavidina con DNA polimerasi ricombinante che non ha attività 3'-5. 'Esonucleasi (che consente la correzione su test o prove- lettura ) e rilevamento della luminescenza tramite l'attività enzimatica della luciferasi . È quindi una miscela di tre enzimi (DNA polimerasi, ATP sulfurilasi e luciferasi) e un nucleotide ( dNTP ) che viene aggiunto a un singolo filamento di DNA che si desidera sequenziare, e l'incorporazione del nucleotide viene seguita nella misurazione della quantità di luce emessa. L'intensità della luce determina se sono stati incorporati 0, 1 o più nucleotidi, il che consente di vedere quanti nucleotidi complementari sono presenti sul filamento modello . La miscela enzimatica con il primo nucleotide viene quindi rimossa dal mezzo prima di aggiungere un'altra miscela con il secondo nucleotide. Questo processo viene ripetuto con ciascuno dei quattro tipi di nucleotidi fino a quando non viene determinata la sequenza del DNA del filamento singolo dello stampo.
Un secondo metodo di pirosequenziamento è stato sviluppato nel 1998 da Ronaghi, Uhlen e Nyren. Viene aggiunto un ulteriore enzima, l' apirasi , il cui ruolo è quello di degradare i nucleotidi in eccesso che non sono incorporati dalla DNA polimerasi. Ciò consente di trattenere la miscela di enzimi durante tutta la procedura, consentendo così al dispositivo di essere autonomo. Uno strumento automatizzato basato su questo principio fu introdotto sul mercato l'anno successivo dalla società Pyrosequencing.
Infine, un terzo metodo alternativo è stato sviluppato nel 2005 da Rothberg e dai suoi collaboratori. Si basa sul principio originale di attaccare il DNA da sequenziare su un supporto solido e il sequenziamento viene eseguito in modo simile agli altri metodi utilizzando un chip di DNA micro - fabbricato . Questo metodo ha consentito il sequenziamento del DNA ad alto rendimento e lo sviluppo di uno strumento automatizzato che è stato successivamente introdotto sul mercato. È diventato il primo strumento di sequenziamento di nuova generazione, aprendo la strada a una nuova era nella genomica , con costi in rapida diminuzione, consentendo il sequenziamento completo del genoma a prezzi accessibili.
Nel principio del "sequenziamento per sintesi", viene prelevato un singolo filamento di DNA da sequenziare e il suo filamento complementare viene quindi sintetizzato enzimaticamente.
Il metodo di pirosequenziamento si basa sulla rilevazione dell'attività della DNA polimerasi con un altro enzima chemiluminescente . In linea di principio, il metodo consente di sequenziare un singolo filamento di DNA sintetizzando il suo filamento complementare alla velocità di una coppia di basi alla volta, rilevando ogni volta quale base è stata aggiunta ad ogni passaggio. Lo stampo di DNA è immobile e le soluzioni dei nucleotidi A , T , G e C vengono aggiunte una dopo l'altra e quindi rimosse dalla reazione. La luce viene prodotta solo quando la soluzione nucleotidica completa la prima base spaiata nella matrice. La sequenza delle soluzioni nucleotidiche che producono segnali chemiluminescenti consente di determinare la sequenza del filamento stampo.
Per quanto riguarda il metodo sviluppato nel 1998, il DNA stampo a filamento singolo viene ibridato ad un primer e incubato con gli enzimi DNA polimerasi, ATP sulfurilasi, luciferasi e apirasi e con i substrati 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosolfato (PAPS) e luciferina .
Dal pirogramma possiamo quindi dedurre la sequenza dalla dimensione dei picchi ottenuti. Inoltre, in caso di miscela di nucleotidi nella stessa posizione ( polimorfismo di sequenza), la dimensione dei picchi consente di quantificare la proporzione di filamenti che trasportano l'uno o l'altro dei nucleotidi.
Attualmente, uno dei limiti del metodo è che le lunghezze delle letture individuali della sequenza di DNA sono comprese tra 300 e 500 nucleotidi, che è inferiore agli 800-1000 nucleotidi che possono essere ottenuti con metodi terminati a catena come il metodo di Sanger. Ciò può rendere più difficile il processo di assemblaggio del genoma, soprattutto per le sequenze contenenti una grande quantità di ripetizioni . La mancanza di attività di correzione di bozze limita l'accuratezza di questo metodo.