Un anticorpo è qualificato come irregolare dagli immunoematologi quando non è sistematicamente presente in soggetti privi dell'antigene corrispondente. Quindi gli anticorpi del sistema del gruppo ABO sono anticorpi regolari, perché qualsiasi soggetto di età superiore a pochi mesi che non ha sostanze A o B, dovrebbe normalmente avere anticorpi anti-B o anti-A nel suo siero. Al contrario, rari sono soggetti RH negativi , quindi privi dell'antigene D (RH1), che hanno anti-D nel siero. Questo anticorpo è quindi qualificato come irregolare. La maggior parte degli anticorpi del gruppo sanguigno sono "anticorpi irregolari".
La ricerca di anticorpi irregolari o cercare agglutinine irregolari (in Francia: RAI, in Belgio: indiretti Coombs ) è un immuno-ematologia esame che permette di dimostrare e di individuare la specificità di anti-eritrociti anticorpi presenti nel. Siero di un paziente prevenire lo shock trasfusionale e / o in una donna incinta al fine di rilevare l'incompatibilità fetale-materna .
Questo test consiste nel far reagire un siero (o plasma ) sconosciuto con un certo numero di globuli rossi noti, vale a dire di cui sono noti i vari antigeni del gruppo sanguigno . Questo insieme di globuli rossi costituisce un pannello .
Il siero sconosciuto posto in presenza di questi globuli rossi causerà agglutinazione (a volte emolisi ) se un anticorpo presente nel siero si lega all'antigene corrispondente presente sul globulo rosso. Altrimenti non c'è agglutinazione.
Le prime reazioni di agglutinazione, facendo semplicemente reagire un siero su globuli rossi non trattati, hanno portato alla scoperta dei gruppi sanguigni ABO. Questa semplice tecnica permette solo di dimostrare i cosiddetti anticorpi agglutinanti, di regola IgM , anticorpi naturali attivi a freddo, a 4 ° C oa temperatura ambiente. Questo è il caso degli anticorpi del sistema ABO, anti-M, anti-N, anti-P1 e raramente o eccezionalmente altre specificità che possono essere tutte viste.
Questa tecnica di agglutinazione è stata migliorata utilizzando tecniche di agglutinazione artificiale.
I globuli rossi sospesi in respingono plasma reciprocamente a causa della presenza sulla loro superficie di cariche negative elettriche (COO - ), oneri che mantengono la presenza di una nube di ioni positivi solidale al globulo, una nuvola la cui densità decresce in s ' lontano dal globulo. La potenziale differenza tra questa nuvola di cationi attaccata al globulo rosso e il mezzo neutro è di -15 mV . Questo potenziale ζ è determinato misurando la mobilità dei globuli rossi in un campo elettrico. Secondo Pollack, il potenziale ζ è proporzionale alla carica σ dei globuli rossi, inversamente proporzionale alla costante dielettrica D del mezzo, e alla radice quadrata della forza ionica μ, oppure ζ = f (σ / D. μ 0,5 ).
Il legame degli anticorpi (che sono molecole anfotere ) neutralizza parzialmente queste cariche e quindi consente alla tensione superficiale e alle forze di Van der Waals di unire questi globuli rossi e di agglutinarli, essendo il potenziale ζ abbassato a circa - 7 mV.
Le IgM di 1 M di peso molecolare sono molto più efficaci nel neutralizzare queste cariche rispetto alle IgG di 160.000 peso molecolare, da qui la qualità degli anticorpi agglutinanti o completi per i primi e non agglutinanti o incompleti per i secondi. Naturalmente, l'agglutinazione dipende anche dal numero di siti antigenici sulla superficie del globulo rosso, da 10 siti 6 A su un globulo rosso A1 a 10 5 su un globulo rosso A2, e da 4000 a 18.000 siti Kell su un globulo rosso cellula Kell positivo.
Il diagramma di Rodney Porter della struttura delle immunoglobuline mostra che l'elemento base di queste molecole è costituito da due catene pesanti e due catene leggere e si dissocia dopo il trattamento con un enzima, in una parte Fc costituita da due frammenti di catena pesanti e in due frammenti Fab , che contengono il sito di legame dell'antigene dell'anticorpo. Si presume quindi che un sito anticorpale si leghi all'antigene situato su un globulo rosso e che il secondo sito dell'immunoglobulina si leghi all'antigene situato su un secondo globulo rosso, costituendo così un "ponte" molecolare tra i due. cellule del sangue che vengono quindi aggregate insieme. A poco a poco il numero dei globuli rossi diventa sempre più importante, fino a costituire importanti agglutinati visibili ad occhio nudo. Questa spiegazione, che è del tutto valida per complessi antigene-anticorpo suscettibili di precipitazione (metodi Ouchterlony e Mancini), è probabilmente secondaria nella fase iniziale per quanto riguarda gli agglutinati dei globuli rossi data la rispettiva dimensione dei globuli rossi (85 a 98 μm3 di volume, da 6,8 a 7,3 μm di diametro) e gli anticorpi coinvolti, specialmente se si tratta di IgG la cui distanza tra i siti anticorpali è al massimo di 15 nm.
Infatti, a seconda della posizione dell'epitopo più o meno sepolto sotto il glicocalix (RH) o all'estremità di una catena proteica o osidica (MNS, ABO), e quindi più o meno distante dalla membrana lipidica, l'accessibilità da parte di gli anticorpi saranno molto diversi. L'unione dei globuli rossi può quindi essere avviata da una diminuzione del potenziale zeta, quindi rinforzata da ponti, o essere avviata da ponti su numerosi epitopi (ABO) e molto esterni o su emimiti deformati che presentano spicole, fissazione iniziale che contribuisce anche per abbassare il potenziale zeta.
La tecnica dell'antiglobulina è ufficialmente riconosciuta in Francia come obbligatoria e sufficiente per la rilevazione di anticorpi irregolari. Gli anticorpi che non vengono rilevati da questa tecnica sono considerati non pericolosi.
Se, ad esempio, su un pannello di quindici globuli rossi, gli otto globuli rossi che trasportano l'antigene D sono agglutinati, e se i sette globuli rossi negativi Rhesus non lo sono, possiamo confermare, grazie ad un test statistico, il Khi- Test . 2 , se applicabile, o di Fisher metodo esatto (vedi la discussione di articolo) nel presente esempio, che il siero testato contiene anticorpo anti-D, con un rischio di errore di circa uno seimila, p = 0,000,155 mila. Il ragionamento è lo stesso per tutti gli anticorpi, il che spiega la difficoltà di costituire pannelli di globuli rossi ben abbinati tra loro, in modo che i risultati osservati siano statisticamente significativi .
Da qui anche la necessità di avere pannelli di globuli rossi sufficientemente grandi, o anche più pannelli, per poter identificare un anticorpo, quando non si tratta di miscele di più anticorpi, come anti-D + C + K + Fya , che si osserva in alcuni pazienti polytransfused. Le differenze di sensibilità delle varie tecniche utilizzabili ci aiutano anche a identificare gli anticorpi che costituiscono queste complesse miscele.
Infine, i globuli rossi del pannello non mostrano tutti la stessa reattività verso alcuni anticorpi di basso titolo o di bassa affinità. Quindi un globulo rosso del fenotipo Rhesus DccEe non sarà agglutinato da un debole anti-E, mentre un globulo rosso del fenotipo ddccEe sarà, che può essere compreso nel caso presente, il globulo rosso DccEe avente tre tipi di proteine RH (RH-D, RH-ce, RH-cE) presumibilmente distribuito più o meno equamente, mentre il globulo rosso ddccEe ne ha solo due e quindi ha un numero leggermente superiore di epitopi E. Allo stesso modo, un globulo rosso MM (M +, N-) che possiede l'antigene M in doppia dose sarà più reattivo nei confronti di un anti-M debole rispetto a un globulo rosso MN (M +, N +). Inoltre, con fenotipi identici, le quantità di antigene o le reattività dei globuli rossi sono variabili da un individuo all'altro, questo è il caso del fenotipo P1.
Affermare la presenza di un anticorpo e identificarlo non è sufficiente per poter trasfondere in sicurezza. È inoltre necessario escludere gli anticorpi che possono essere mascherati dagli anticorpi identificati. Ad esempio, dovremo testare i globuli Rhesus CC (c-), Jk (a +, b-) per escludere la possibile presenza di un anti-Jka in un paziente con un anti-c (anti-RH4) . Alcune combinazioni fenotipiche sono estremamente rare. Pertanto, solo un globulo del fenotipo CCEe nel sistema Rhesus consentirà di eliminare la presenza di una formica E frequentemente associata ad un anti-c. Infine, il fenotipo del paziente nei vari sistemi consente di escludere la presenza di allo-anticorpi corrispondenti agli antigeni dimostrati.
Questo controllo per gli anticorpi irregolari è obbligatorio:
Inoltre, va notato che tutti gli anticorpi che possono essere rilevati non hanno la stessa importanza clinica, alcuni di questi anticorpi non hanno mai causato un incidente trasfusionale. Possiamo citare, ad esempio, anti-Wright a, anti-N, ecc. Alcuni anticorpi che sono attivi solo nelle tecniche enzimatiche sono anche considerati non pericolosi. Questi anticorpi non pericolosi, così come gli anticorpi di tipo HTLA (High Title Low Affinity), sono ben noti agli istituti di trasfusione.
Al contrario, alcuni anticorpi o miscele di anticorpi pericolosi rendono molto difficili alcune trasfusioni a causa della mancanza di donatori compatibili. Ad esempio, tra gli unici donatori ABO e RH compatibili, meno di quattro donatori su mille sono adatti quando il paziente da trasfondere porta un anti-K2 (anti-Cellano). Da qui l'interesse per la ricerca di anticorpi irregolari post-trasfusione o durante la valutazione preoperatoria per non essere sorpresi, né mancare, in caso di emergenza.
La presenza di anticorpi irregolari porta, prima di qualsiasi trasfusione, sistematicamente a livello medico-legale, ma più ragionevolmente solo quando persiste un dubbio, alla realizzazione di un test diretto di compatibilità (in Francia: EDC) in laboratorio. Questo test, chiamato anche cross-matching (inglese: cross-reazione), consiste nel testare, nelle stesse tecniche della ricerca di anticorpi irregolari, il siero o il plasma del paziente contro i concentrati di eritrociti di fenotipo compatibile previsti per la sua trasfusione. . Pertanto, se un anticorpo non è stato sottoposto a screening o identificato durante la ricerca di anticorpi irregolari, può essere rilevato se l'unità sanguigna pianificata è incompatibile. Verranno quindi scelte e testate altre unità.
Questo test a volte permette di evidenziare un'incompatibilità dovuta ad un eccezionale antigene privato, presente sui globuli rossi del donatore, l'anticorpo presente nel ricevente solo raramente viene rilevato durante la ricerca di anticorpi irregolari. Questo test verrà quindi eseguito sistematicamente per un destinatario noto per avere un eccezionale anti-privato, ad esempio anti-MNS9. Questo test può essere eseguito anche in riceventi regolarmente trasfusi con sangue fenotipizzato (talassemia, anemia falciforme, Blacfan Diamond, deficit enzimatico-piruvato-chinasi, ecc.) E quindi che ricevono solo sangue da pochi donatori selezionati, e probabilmente in questo caso a sviluppare un anticorpo anti-privato.
Un RAI negativo consente a un paziente di essere trasfuso in tutti i casi, ad eccezione dei noti antiprivati, che richiedono una trasfusione. Se la RAI è positiva e l'anticorpo identificato, il paziente verrà trasfuso urgentemente in unità fenotipizzate. I testi impongono, per qualsiasi RAI positivo, compatibilità di laboratorio, che può essere inutile quando l'anticorpo è ben identificato (anti E isolato ad esempio) e provoca ritardi che possono essere causa di morte (questi casi sono fortunatamente rari, la nozione di vitale emergenza che consente di svolgere la RAI e l'EDC quando le RMC sono già state rilasciate al servizio sanitario). La RAI è quindi indicata per trasfusioni imprevedibili, urgenti e / o pesanti.
L' EDC offre un'ulteriore garanzia di sicurezza trasfusionale per qualsiasi anticorpo già dimostrato o noto (secondo i testi), consentendo di evidenziare un'incompatibilità legata ad un anticorpo anti-privato, o non ancora identificato o mascherato da un anticorpo noto - anti-Jka mascherato da anti-c per esempio. Ma questo test ritarda la trasfusione, poiché ogni unità programmata deve essere testata: tempo dal test stesso da aggiungere al tempo di trasporto tra il laboratorio e la struttura di cura. Questa garanzia è anche in alcuni casi perfettamente illusoria, quando l'anticorpo rilevato (anti JK, anti MNS3, ecc.) È dimostrato solo sui globuli rossi omozigoti del pannello per l'antigene considerato. In questo caso, un test di compatibilità negativo effettuato in cieco su unità non fenotipizzate non garantisce la sicurezza trasfusionale. L' EDC può tuttavia essere eseguito su unità fenotipizzate per trasfusioni urgenti immediate non vitali o non programmate e di solito coinvolge poche unità di globuli rossi.