Spettrofotometro

Uno spettrofotometro è uno strumento per eseguire una misurazione spettrofotometrica . Uno spettrometro , o spettroscopio , è un dispositivo che consente di eseguire una spettrometria di misura della assorbanza di una soluzione ad una determinata lunghezza d'onda o su una data regione dello spettro .

Principio

Secondo la legge di Beer-Lambert , l'assorbanza di una soluzione è proporzionale alla concentrazione delle sostanze in soluzione, purché si trovi alla lunghezza d'onda alla quale la sostanza assorbe i raggi luminosi. Questo è il motivo per cui la lunghezza d'onda viene regolata in base alla sostanza di cui vogliamo conoscere la concentrazione.

• Secondo la legge di Beer-Lambert, l'assorbanza è funzione della concentrazione C della soluzione, del coefficiente di assorbimento molare e della lunghezza della soluzione da attraversare per L.Aλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Aλ=-log10⁡ioio0=ελ⋅ℓ⋅VS{\ displaystyle A _ {\ lambda} = - \ log _ {10} {\ frac {I} {I_ {0}}} = \ varepsilon _ {\ lambda} \ cdot \ ell \ cdot C}

ioio0{\ displaystyle {\ frac {I} {I_ {0}}}}

• Si noti che e sono una funzione della lunghezza d'onda di lavoro, viene scelta in funzione degli spettri di assorbanza.Aλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Qui i due spettri sono sovrapposti, per realizzarli indipendentemente abbiamo misurato l'assorbanza di una soluzione di NAD + (rispettivamente di NADH, H + ) a diverse lunghezze d'onda (a parità di condizioni).

La lunghezza d'onda di assorbimento massima qui è max = 260  nm per le due molecole. Sarà quindi preferibile lavorare a questa lunghezza d'onda. D'altra parte, se vogliamo dosare NADH, H + durante una reazione enzimatica in cui NAD + è ridotto a NADH, H + per esempio, è più giudizioso lavorare a = 340  nm perché qui misuriamo solo NADH, H + perché l'assorbanza di NAD + è zero anche se è presente nella miscela. λ{\ displaystyle \ lambda}λ{\ displaystyle \ lambda}

Gli spettrometri a infrarossi (IR) sono utilizzati principalmente per l'identificazione. Si può dire che, in pratica, gli spettrometri UV-visibili vengono utilizzati per analisi quantitative mentre gli spettrometri IR sono strumenti qualitativi. Entrambi utilizzano principi ottici simili, ma la frequenza dello spettrometro IR scansiona il campione.

Galleria:

• Spettrometro da laboratorio (coperchio aperto).

• Spettrometro da laboratorio (chiuso).

• Un altro modello.

• Spettrometro palmare per la misurazione del colore (spesso espresso nel sistema L * a * b * ) di una superficie.

Lo spettrometro UV-visibile (UV: ultravioletto) comprende:

• una o più sorgenti luminose  : luce bianca per la misurazione nello spettro visibile ( luce policromatica ) e/o luce UV.
  • La lampada UV è generalmente del tipo al deuterio (range da 195 a 380  nm , durata della lampada di 1000  h , ad esempio).
  • La lampada visibile è generalmente di tipo alogena (range da 320 a 1000  nm , durata di vita di 500  h , ad esempio).
  • Esistono anche spettrometri a lampada allo xeno; (intervallo da 190 a 1.100  nm )
• un monocromatore formato da una rete che diffrange la luce dalla sorgente. Permette di selezionare la lunghezza d'onda della luce che attraverserà la soluzione da dosare;
• uno slot a larghezza fissa o variabile per regolare la larghezza di banda;
• un portacuvette che può permettere di mantenere la soluzione da analizzare alla temperatura desiderata, tale temperatura viene mantenuta da un circuito idraulico o per effetto Peltier . Questo mantenimento ad una temperatura fissa è molto utile nelle misure di cinetica enzimatica , infatti la velocità di reazione dipende dalla temperatura;
• una cuvetta trasparente nella quale viene posta la soluzione da studiare. A seconda della qualità e della quantità del campione, esistono diverse cuvette, generalmente di plastica (spettro visibile, vicino ai raggi UV) o di quarzo (UV, ma cuvette molto costose).

Il solvente e il/i reagente/i utilizzato/i non sono sempre trasparenti, è obbligatorio eseguire un indicatore di "vuoto" o di compensazione, ovvero un azzeramento del dispositivo (tara), ponendo solo il solvente e il reagente ( s) utilizzato nella cuvetta, prima della misurazione della cuvetta contenente il campione, per ciascuna lunghezza d'onda studiata.
I progetti di ricerca sono generalmente a doppio raggio e utilizzano due cuvette, la cuvetta di riferimento contenente il solvente e il/i reagente/i e la cuvetta contenente il campione (con solvente e reagente/i). Il liquido nella cuvetta di riferimento viene quindi automaticamente sottratto (funzione di auto-zero);

• una fotocellula , ripristinando una corrente proporzionale al numero di fotoni ricevuti. Sui modelli recenti, il rivelatore di tipo a fotodiodo singolo è talvolta sostituito da un array CCD o un array di diodi (ogni cella sensibile riceve un colore fisso). I modelli più sensibili utilizzano un fotomoltiplicatore o un rivelatore di tipo PMT;
• un rivelatore elettronico la cui risposta è proporzionale a questa corrente elettrica e permette una misura relativa dell'intensità luminosa.

La spettrometria viene utilizzata principalmente per determinare la concentrazione di una soluzione colorante (un processo chiamato dosaggio colorimetrico ).

Aree di applicazione

In biologia

• Lo spettrometro viene utilizzato durante l'esecuzione del test MTT .
• In biologia molecolare , viene utilizzato durante l'estrazione del DNA , per quantificare il DNA e determinarne la purezza. Viene utilizzata la lunghezza d' onda di 260  nm , che è l'area di massimo assorbimento degli acidi nucleici. Una seconda misura a 280  nm permette di verificare la purezza dell'estrazione, ovvero la presenza di proteine ​​residue nella soluzione di DNA.

Per una soluzione di DNA purificato, il rapporto R dovrebbe essere compreso tra 1,8 e 2. Se R è significativamente inferiore a 1,8, allora le proteine ​​probabilmente stanno contaminando la soluzione. Maggiore di 2, questo rapporto indica una probabile contaminazione da RNA.

La concentrazione di DNA può essere calcolata dalla misurazione a 260  nm utilizzando un fattore di correlazione:

• DNA a doppio filamento: 1 Abs = 50 ng / µl
• DNA a filamento singolo: 33 ng / µl (come RNA a filamento singolo)
• RNA: 1 Abs = 40 ng/µl.

In biochimica , viene utilizzato durante la purificazione delle proteine, per quantificarle (lunghezza d'onda 280  nm ) e per determinarne il livello di purezza (lunghezza d'onda 260  nm ).

In medicina

Analisi cinetica di diversi enzimi ematici, determinazione della fosfatasi alcalina: colestasi, lattato deidrogenasi: infarto del miocardio, emolisi.

In fisica

L'analisi della luce permette di determinare i componenti chimici che causano l'emissione di luce: ad esempio, la composizione chimica delle stelle.

In chimica

L'analisi dell'assorbimento di soluzioni ad una data lunghezza d'onda permette il dosaggio di queste soluzioni secondo la legge di Beer-Lambert (la concentrazione è proporzionale al logaritmo dell'assorbimento luminoso). Esiste quindi una relazione diretta tra la quantità di luce assorbita e la concentrazione del composto chimico nella soluzione. Il monitoraggio dell'assorbimento nel tempo è un metodo per caratterizzare la velocità delle reazioni chimiche (cinetica).

Uno sweep di frequenza permette di caratterizzare le specie presenti in soluzione risalendo alla natura della transizione energetica considerata.

Nelle industrie grafiche

Viene utilizzato per misurare i colori al fine di calibrare i dispositivi di output come i plotter .

Bibliografia

• Georges Bruhat , Optique , sesta edizione, raccolta di corsi di riferimento, Dunod, 2005, 1152 p.

Vedi anche

• Spettrofotometria
• spettrometria

Note e riferimenti

1. Cfr. G. Bruhat (2005), Ottica , sesta edizione, Dunod: § Spettrofotometria.
2. Per omogeneità con l'unità generalmente utilizzata per il coefficiente di assorbimento molare, la lunghezza è espressa in cm. Questo è il motivo per cui la maggior parte delle cuvette sono standardizzate a L = 1  cm .