La microscopia a fluorescenza (o epifluorescenza ) è una tecnica che utilizza un microscopio ottico sfruttando il fenomeno della fluorescenza e della fosforescenza al posto o in aggiunta all'osservazione convenzionale per riflessione o assorbimento della luce visibile naturale o artificiale.
Possiamo così osservare vari oggetti, sostanze (organiche o inorganiche) o campioni di organismi morti o viventi.
Ora fa parte dei metodi di ricerca classici e della biologia e continua a svilupparsi con l'imaging molecolare .
La fluorescenza è la proprietà posseduta da alcuni corpi di emettere luce dopo aver assorbito fotoni di energia più elevata. La microscopia a fluorescenza si basa sulla formazione di un'immagine mediante il rilevamento di questa luce emessa. Lo spostamento di Stokes descrive la differenza tra la lunghezza d'onda assorbita dalla lunghezza dell'oggetto (emessa dalla sorgente luminosa del microscopio) ed emessa dall'oggetto. Maggiore è la differenza tra le due lunghezze d'onda, più facile è osservare la fluorescenza.
Nella fluorescenza si distinguono due tipi di oggetti:
Nella microscopia a fluorescenza è quindi possibile visualizzare direttamente le sostanze fluorescenti. Per le sostanze, le cellule, le molecole non fluorescenti, è necessario contrassegnarle con sostanze chiamate fluorocromi, come DAPI che segna il DNA e fluorescente in blu.
Alcuni marcatori genetici come la proteina fluorescente verde (in inglese Green Fluorescent Protein o GFP) sono anche ampiamente utilizzati in biologia negli organismi geneticamente modificati per produrli in modo endogeno . In questo caso, il fluorocromo è una proteina prodotta direttamente dalla cellula stessa e non necessita dell'aggiunta di substrato. La fluorescenza può quindi essere visualizzata direttamente nelle cellule viventi, questo è uno dei campi sviluppati dall'imaging molecolare .
Possono essere utilizzate molte tecniche di marcatura:
Le sostanze fluorescenti possono essere eccitate dall'eccitazione di un singolo fotone. Per questo viene utilizzata una luce di eccitazione, la cui lunghezza d'onda eccita direttamente il fluoroforo. Pertanto, la fluorescenza emessa può provenire dall'intero spessore del campione attraversato dal fascio di eccitazione. L'elemento chiave di questo microscopio confocale è quindi rappresentato da una "finestra" (un foro di spillo o un'iride confocale) posta davanti al rivelatore che elimina la fluorescenza dalle regioni non focali. L'osservazione dei segnali di fluorescenza si basa su cinque elementi:
Questa eccitazione consiste nell'assorbimento quasi simultaneo di diversi fotoni di eccitazione di una lunghezza d'onda prossima a un multiplo dell'eccitazione ottimale in un fotone. Per questo, un laser pulsato viene utilizzato in frequenze vicine all'infrarosso. In questo caso, solo il punto focale del raggio laser è un eccitatore (densità di fotoni sufficiente per accoppiare l'energia di eccitazione). Spesso le applicazioni sono limitate alla microscopia a due fotoni (eccitazione del fluoroforo da parte di due fotoni).
Questo sistema è considerato un importante sviluppo tecnologico per tre ragioni principali:
In pratica, l'efficienza di emissione di fluorescenza è meno buona di quella di un singolo fotone confocale e il rapporto segnale / rumore è inferiore. Pertanto, mostra poco vantaggio per l'osservazione di cellule in coltura o sezioni di tessuto (50-70 µm di spessore).
Questa tecnica è naturalmente utilizzata per l'eccitazione simultanea di più fluorofori con diversi spettri di emissione.
Una variante di questa tecnica è la microscopia a fluorescenza mediante eccitazione multifocale multifotone . Il principio è identico, ma il raggio laser è diviso in più raggi che consentono di scansionare più punti contemporaneamente. Ciò consente di ridurre i tempi di acquisizione delle immagini.
Le tecniche di fluorescenza possono essere utilizzate con diversi tipi di microscopio:
Questi dispositivi hanno parti intercambiabili a forma di cubo disposte su una torretta rotante o su una linguetta di trazione a seconda del produttore.
Questi "cubi" filtrano la luce andando verso l'obiettivo e andando verso l'osservatore o il sensore, a seconda delle fluorescenze ricercate.
Comprendono 2 filtri e un particolare specchio "dicroico" che riflette determinate lunghezze d'onda e che viene attraversato da altre.
Verso la sorgente c'è il filtro di eccitazione.
Dal lato dell'osservatore c'è il filtro barriera.
I cubi sono elencati in base alle luci di eccitazione: ultravioletto, viola, blu, verde ...
Questa tecnica viene utilizzata, in particolare, per osservare monostrati lipidici a cui è stata aggiunta una sonda lipidica fluorescente. La fluorescenza si osserva a seconda della fase in cui si trova il lipide principale. In generale, la sonda è solubile nella fase liquida espansa (LE) ma non nelle fasi gassosa (G) o solida (S). Ciò consente di osservare le macrostrutture formate dal monostrato. Di fronte, un monostrato lipidico in equilibrio viene osservato mediante microscopia a epifluorescenza . La sonda lipidica fluorescente è solubile nella fase LE ma non nella fase G. Il risultato è che si osservano, all'equilibrio, tipi di bolle (ma una "bolla" è un concetto tridimensionale) di cui sono costituite le pareti lipidi in fase LE e l'interno in fase G. Se prendiamo un esempio tridimensionale, sarebbe come prendere una schiuma di sapone e tagliarne una fetta molto sottile.
Immagini in epifluorescenza di tre componenti di una cellula tumorale umana in divisione. Il DNA appare blu, una proteina chiamata INCENP appare in verde e i microtubuli in rosso. Ogni fluoroforo è stato ripreso separatamente, con una specifica lunghezza d'onda di eccitazione e filtri, quindi è stata ricomposta un'immagine, dalle foto scattate dalla camera CCD .
Cellule endoteliali di un'arteria polmonare bovina (nuclei colorati in blu con DAPI, microtubuli etichettati in verde con un anticorpo legato a FITC e filamenti di actina etichettati in rosso con falloidina legata alla proteina TRITC).
Nucleo linfocitario umano colorato con DAPI con cromosomi 13 (verde) e 21 (rosso) da sonde ibridate a centromeri ( ibridazione in situ in fluorescenza ).
Membrana cellulare di lievito , dimostrazione della struttura (in giallo) ottenuta dalla fusione di proteine di membrana con due marcatori fluorescenti (RFP e GFP).
Rilevazione della molecola YFP in una cellula tumorale umana, su scala nanometrica.
Nucleo di una cellula di cancro alle ossa (tecnica chiamata microscopia di localizzazione a due colori o 2CLM per chi parla inglese). Immagine ottenuta mediante fluorescenza di marcatori fusi con le proteine GFP e RFP, per 120.000 molecole situate in un'area ristretta (470 µm 2 ).